Прочтенный недавно геном шимпанзе поможет людям в борьбе с болезнями, к которым наши ближайшие родственники более устойчивы, чем мы. Рак — одна из таких болезней (изображение с сайта www.genome.gov)

Испанские ученые сравнили нуклеотидные последовательности генов, связанных с развитием раковых опухолей, у человека и шимпанзе. Выявлено более 1500 различий. Генетики полагают, что детальный анализ этих различий позволит найти причину загадочной устойчивости обезьян к онкологическим заболеваниям.

Ежегодно в мире около 6 млн человек умирает от рака. По прогнозам ВОЗ, эта цифра через пару десятилетий может удвоиться. Причины рака многочисленны, разнообразны и во многом загадочны. Медики различают более 200 видов онкологических заболеваний, каждое из которых имеет свою специфику, однако у них есть общая основа: неконтролируемое размножение клеток.

Причиной заболевания могут стать самые разные нарушения сложнейших механизмов, контролирующих деление клеток нашего организма, а также их апоптоз — программируемую смерть (точнее говоря, самоубийство). Во многих случаях непосредственной причиной рака являются мутации, возникающие в течение жизни в отдельных клетках человеческого тела. Выявлено множество человеческих генов, мутации в которых чреваты развитием злокачественных новообразований. В большинстве своем это очень важные, совершенно необходимые для жизни гены, отвечающие за целостность организма и не позволяющие отдельным клеткам забывать о том, что главная их задача — функционировать на благо целого.

Помимо прижизненных мутаций, происходящих в отдельных клетках взрослого организма, большую роль в онкологии играет наследственная предрасположенность. Известен ряд генов, определенные вариации (аллели) которых, передаваемые по наследству, влияют на вероятность тех или иных онкологических заболеваний.

Известно, что наши ближайшие родственники — шимпанзе и другие приматы — болеют раком чрезвычайно редко. Причины тому могут быть разные: более здоровый образ жизни, отсутствие характерного только для людей долгого «пострепродуктивного периода» (вероятность рака растет с возрастом, а обезьяны умирают, не успев состариться). Кроме того, устойчивость приматов к раку может быть обусловлена генетическими причинами. Сравнив геном человека с недавно прочтенным геномом шимпанзе, можно попытаться найти те генетические особенности наших родичей, которые обусловили их невосприимчивость к одной из самых страшных для человека болезней.

Хосе Пуэнте из испанского Университета Овьедо и его коллеги из Испании и США сравнили 333 человеческих гена, связанных с развитием раковых опухолей, с соответствующими (ортологичными) генами шимпанзе. Выяснилось, что у шимпанзе имеются ортологи всех этих генов без исключения (это еще раз подтверждает, что гены, связанные с онкологией, относятся к числу жизненно важных). Для сравнения, из 560 генов протеаз (белков, расщепляющих другие белки) человека и шимпанзе 7 отсутствуют либо у одного, либо у другого вида.

Сходство аминокислотных последовательностей белков, кодируемых вышеупомянутыми 333 генами, у человека и шимпанзе составляет 99,38% (что соответствует среднему уровню сходства белков у наших видов). Тем не менее между «онкогенными» белками человека и шимпанзе обнаружено 1542 различия (под единичным различием понимается замена, утрата или вставка одной аминокислоты). Любое из этих различий может оказаться важным, так что авторы обеспечили себя и своих последователей достаточным объемом работы на долгие годы.

Особого внимания, по мнению авторов, заслуживает различие, обнаруженное в гене p53. 72-ую позицию в белке p53 у шимпанзе (и, по-видимому, у всех остальных обезьян) занимает аминокислота пролин, а у людей — аргинин. Правда, не у всех. От 8 до 45% людей (частота аллеля варьирует у разных народов) имеют «обезьяний» вариант белка с пролином в 72-ой позиции. «Аргининовый» вариант белка p53 — чисто человеческое новоприобретение, не встречающееся у обезьян. По некоторым данным, люди с таким белком имеют повышенные шансы заболеть раком (хотя этот факт некоторыми специалистами оспаривается и нуждается в дополнительной проверке).

Возможно, аргинин в 72-ой позиции дает людям какое-то другое, пока неизвестное, преимущество, более важное, чем повышенный риск онкологических заболеваний. Когда дело касается ключевых белков, контролирующих базовые клеточные функции, даже изменение одной аминокислоты может иметь множество разнообразных последствий, и не так-то просто найти оптимальный компромисс между разнообразными и противоречивыми «требованиями», предъявляемыми организмом и внешней средой к каждому такому белку.

Источник: Puente X. S. et al. Comparative analysis of cancer genes in the human and chimpanzee genomes (Pdf, 196 Кбайт) // BMC Genomics 2006, 7:15.

См. также:
Веб-страничка Всемирной организации здравоохранения, посвященная раку.
Геном шимпанзе.

Александр Марков

Ретровирус довольно сложно устроен и ведет себя почти как живой организм. Тем не менее ретровирусы – не самостоятельные живые существа, а причудливый результат эгоистической эволюции отдельных фрагментов генома настоящих живых организмов. Изображение с сайта http://www.genciencia.com

Ретровирусы могли произойти от ретротранспозонов – подвижных участков генома эукариот – в результате приобретения одного дополнительного гена, env, обеспечивающего способность вируса проникать внутрь эукариотической клетки. Ген env мог быть заимствован ретротранспозонами у ДНК-содержащих (не «ретро-») вирусов, а те, в свою очередь, заимствовали его у хозяев – эукариотических организмов.

Ближайшими родственниками ретровирусов , к числу которых относится вирус ВИЧ, являются ретротранспозоны – мобильные генетические элементы, широко распространенные в геномах эукариот. В отличие от ретровирусов, ретротранспозоны передаются от клетки к клетке только «по наследству», то есть вертикально. Они могут перемещаться и размножаться внутри хозяйского генома, но не могут передаваться горизонтально от клетки к клетке или от организма к организму. Иными словами, у них нет свойства, называемого «инфекционностью».

Вместе с тем ретровирусы, встроившиеся в геном хозяина, и ретротранспозоны очень похожи друг на друга. Те и другие представляют собой фрагменты ДНК, содержащие более или менее стандартный комплект генов, необходимых для собственного копирования и встраивания в хозяйскую ДНК. Гены эти в большинстве своем сходны у ретровирусов и ретротранспозонов. Обе разновидности «ретроэлементов» размножаются при помощи обратной транскрипции , т.е. переписывания информации с РНК на ДНК.

Родство ретровирусов и ретротранспозонов не вызывает никакого сомнения, однако вопрос о том, кто из них появился раньше и кто от кого произошел, остается открытым. Большинство специалистов склоняется к тому, что первыми появились ретротранспозоны. Они проще устроены, и самые простые из них вполне могли «самозародиться» в геномах примитивных организмов в результате случайных мутаций. По-видимому, это произошло еще на уровне прокариот (бактерий). Долгое время считалось, что ретроэлементы характерны только для эукариот, однако потом удалось и у бактерий обнаружить примитивные ретроэлементы (ретроны, ретроинтроны, ретроплазмиды). Обзор современных данных о происхождении и эволюции ретроэлементов см. в статье: Jef D. Boeke, 2003. The Unusual Phylogenetic Distribution of Retrotransposons: A Hypothesis // Genome Res. 13:1975-1983. Другим аргументом в пользу первичности ретротранспозонов является то, что они более многочисленны и распространены гораздо шире, чем ретровирусы, которые в основном приурочены лишь к позвоночным животным.

Стало быть, ретровирусы, скорее всего, являются результатом некоторого усложнения или, если угодно, «совершенствования» ретротранспозонов. В дальнейшем, конечно, могли происходить и обратные процессы – ведь ретровирус сравнительно легко может снова превратиться в ретротранспозон, если потеряет инфекционность в результате какой-нибудь мутации.

Сотрудники кафедры генетики биологического факультета МГУ Л. Н. Нефедова и А. И. Ким детально изучили строение разнообразных ретроэлементов, имеющихся в геноме дрозофилы, чтобы понять, каким путем ретротранспозоны могли превратиться в ретровирусы. В основе исследования лежал сравнительный анализ нуклеотидных и аминокислотных последовательностей генов и белков различных ретроэлементов, а также их хозяев.

Наиболее вероятный путь эволюции ретроэлементов выглядит следующим образом. По-видимому, началось все с обратной транскриптазы – фермента, синтезирующего молекулы ДНК на матрице РНК (этот процесс называется обратной транскрипцией). Обратная транскриптаза – очень древний фермент. Возможно, он сыграл ключевую роль при переходе от РНК-мира к привычному нам ДНК-миру.

Простейший из теоретически возможных ретроэлементов (нечто подобное встречается у бактерий) – это ген такой обратной транскриптазы, которая способна синтезировать молекулу ДНК на матрице своей собственной РНК. Работает все это так. Сначала хозяйская клетка «считывает» ген обратной транскриптазы, то есть осуществляет его транскрипцию (синтез РНК на матрице ДНК). Затем на матрице РНК синтезируется белок – сама обратная транскриптаза. Этот этап тоже выполняется хозяйской клеткой. Обратная транскриптаза затем находит «свою» РНК и на ее основе путем обратной транскрипции синтезирует ДНК. В результате получается копия исходного гена, с которого все и началось.

Тут, правда, есть еще один нюанс. Синтезированная путем обратной транскрипции ДНК ретроэлемента должна быть встроена в хозяйский геном. Для этого хромосому хозяина нужно разорвать, и синтезировать ДНК ретроэлемента как продолжение одного из образовавшихся свободных концов хозяйской ДНК.

Изначально с этой дополнительной работой – разрыванием хозяйской ДНК – справлялась, по-видимому, сама обратная транскриптаза. Но в дальнейшем ретроэлементы обзавелись дополнительным (вторым по счету) геном, который кодирует специальный белок, приспособленный именно для этой функции – эндонуклеазу. Эндонуклеазы – ферменты, разрезающие ДНК в определенных местах – есть практически у всех организмов, и ретроэлементам не составило труда заимствовать их у хозяев.

Такие простейшие ретротранспозоны, содержащие всего два гена – обратной транскриптазы и эндонуклеазы – реально существуют у дрозофилы.

Следующий этап усложнения ретротранспозонов был связан с тем, что эндонуклеаза была модифицирована и превратилась в интегразу – фермент с несколько иной функцией. Интеграза осуществляет встраивание уже готовой ДНК ретроэлемента в хозяйский геном. В результате весь механизм размножения ретроэлемента меняется. Если раньше обратная транскрипция осуществлялась в ядре хозяйской клетки, и ДНК ретроэлемента с самого начала строилась как «продолжение» оборванной цепи хозяйской ДНК, то теперь обратная транскрипция стала осуществляться в цитоплазме. Готовая ДНК-копия ретроэлемента затем транспортируется из цитоплазмы в ядро, и здесь интеграза встраивает ее в хозяйский геном. Интегразы ретроэлементов дрозофилы способны, кроме того, вырезать из хозяйской ДНК свой ретроэлемент, что делает их похожими на транспозазы (см.: Растения заимствуют гены у «геномных паразитов» ).

Ближайшими родственниками ретровирусов , к числу которых относится вирус ВИЧ, являются ретротранспозоны – мобильные генетические элементы, широко распространенные в геномах эукариот. В отличие от ретровирусов, ретротранспозоны передаются от клетки к клетке только «по наследству», то есть вертикально. Они могут перемещаться и размножаться внутри хозяйского генома, но не могут передаваться горизонтально от клетки к клетке или от организма к организму. Иными словами, у них нет свойства, называемого «инфекционностью».

Вместе с тем ретровирусы, встроившиеся в геном хозяина, и ретротранспозоны очень похожи друг на друга. Те и другие представляют собой фрагменты ДНК, содержащие более или менее стандартный комплект генов, необходимых для собственного копирования и встраивания в хозяйскую ДНК. Гены эти в большинстве своем сходны у ретровирусов и ретротранспозонов. Обе разновидности «ретроэлементов» размножаются при помощи обратной транскрипции , т.е. переписывания информации с РНК на ДНК.

Родство ретровирусов и ретротранспозонов не вызывает никакого сомнения, однако вопрос о том, кто из них появился раньше и кто от кого произошел, остается открытым. Большинство специалистов склоняется к тому, что первыми появились ретротранспозоны. Они проще устроены, и самые простые из них вполне могли «самозародиться» в геномах примитивных организмов в результате случайных мутаций. По-видимому, это произошло еще на уровне прокариот (бактерий). Долгое время считалось, что ретроэлементы характерны только для эукариот, однако потом удалось и у бактерий обнаружить примитивные ретроэлементы (ретроны, ретроинтроны, ретроплазмиды). Обзор современных данных о происхождении и эволюции ретроэлементов см. в статье: Jef D. Boeke, 2003. The Unusual Phylogenetic Distribution of Retrotransposons: A Hypothesis // Genome Res. 13:1975-1983. Другим аргументом в пользу первичности ретротранспозонов является то, что они более многочисленны и распространены гораздо шире, чем ретровирусы, которые в основном приурочены лишь к позвоночным животным.

Стало быть, ретровирусы, скорее всего, являются результатом некоторого усложнения или, если угодно, «совершенствования» ретротранспозонов. В дальнейшем, конечно, могли происходить и обратные процессы – ведь ретровирус сравнительно легко может снова превратиться в ретротранспозон, если потеряет инфекционность в результате какой-нибудь мутации.

Сотрудники кафедры генетики биологического факультета МГУ Л. Н. Нефедова и А. И. Ким детально изучили строение разнообразных ретроэлементов, имеющихся в геноме дрозофилы, чтобы понять, каким путем ретротранспозоны могли превратиться в ретровирусы. В основе исследования лежал сравнительный анализ нуклеотидных и аминокислотных последовательностей генов и белков различных ретроэлементов, а также их хозяев.

Наиболее вероятный путь эволюции ретроэлементов выглядит следующим образом. По-видимому, началось все с обратной транскриптазы – фермента, синтезирующего молекулы ДНК на матрице РНК (этот процесс называется обратной транскрипцией). Обратная транскриптаза – очень древний фермент. Возможно, он сыграл ключевую роль при переходе от РНК-мира к привычному нам ДНК-миру.

Простейший из теоретически возможных ретроэлементов (нечто подобное встречается у бактерий) – это ген такой обратной транскриптазы, которая способна синтезировать молекулу ДНК на матрице своей собственной РНК. Работает все это так. Сначала хозяйская клетка «считывает» ген обратной транскриптазы, то есть осуществляет его транскрипцию (синтез РНК на матрице ДНК). Затем на матрице РНК синтезируется белок – сама обратная транскриптаза. Этот этап тоже выполняется хозяйской клеткой. Обратная транскриптаза затем находит «свою» РНК и на ее основе путем обратной транскрипции синтезирует ДНК. В результате получается копия исходного гена, с которого все и началось.

Тут, правда, есть еще один нюанс. Синтезированная путем обратной транскрипции ДНК ретроэлемента должна быть встроена в хозяйский геном. Для этого хромосому хозяина нужно разорвать, и синтезировать ДНК ретроэлемента как продолжение одного из образовавшихся свободных концов хозяйской ДНК.

Изначально с этой дополнительной работой – разрыванием хозяйской ДНК – справлялась, по-видимому, сама обратная транскриптаза. Но в дальнейшем ретроэлементы обзавелись дополнительным (вторым по счету) геном, который кодирует специальный белок, приспособленный именно для этой функции – эндонуклеазу. Эндонуклеазы – ферменты, разрезающие ДНК в определенных местах – есть практически у всех организмов, и ретроэлементам не составило труда заимствовать их у хозяев.

Такие простейшие ретротранспозоны, содержащие всего два гена – обратной транскриптазы и эндонуклеазы – реально существуют у дрозофилы.

Следующий этап усложнения ретротранспозонов был связан с тем, что эндонуклеаза была модифицирована и превратилась в интегразу – фермент с несколько иной функцией. Интеграза осуществляет встраивание уже готовой ДНК ретроэлемента в хозяйский геном. В результате весь механизм размножения ретроэлемента меняется. Если раньше обратная транскрипция осуществлялась в ядре хозяйской клетки, и ДНК ретроэлемента с самого начала строилась как «продолжение» оборванной цепи хозяйской ДНК, то теперь обратная транскрипция стала осуществляться в цитоплазме. Готовая ДНК-копия ретроэлемента затем транспортируется из цитоплазмы в ядро, и здесь интеграза встраивает ее в хозяйский геном. Интегразы ретроэлементов дрозофилы способны, кроме того, вырезать из хозяйской ДНК свой ретроэлемент, что делает их похожими на транспозазы (см.: Растения заимствуют гены у «геномных паразитов»).

Почему иммунная система человека не в силах противостоять ВИЧ (на фото), тогда как некоторые обезьяны имеют к нему врожденный иммунитет? «Археологические раскопки» в геномах приматов позволили найти ответ. (Изображение с сайта www.eleventh-avenue-south.com)

В геномах шимпанзе и гориллы сохранились остатки наследственного материала ретровируса PtERV1, который утратил инфекционность и стал частью обезьяньих геномов 3-4 млн лет назад. Американские ученые «воскресили» древний вирус и показали, что человеческий антивирусный белок TRIM5α обеспечивает мощную защиту против этой доисторической инфекции. Побочным следствием выработки врожденного иммунитета к PtERV1 стала утрата белком TRIM5α способности противостоять некоторым другим ретровирусам, в том числе возбудителю СПИДа.

Геномы многих животных, в том числе приматов, битком набиты так называемыми эндогенными ретровирусами. Это копии геномов вирусов, в прошлом вполне активных и заразных, которые сумели преодолеть «барьер Вейсмана» (Weismann barrier) и проникнуть в половые клетки, но потом в результате мутаций утратили инфекционность и стали частью генома хозяина. Таким образом, эндогенные ретровирусы представляют собой нечто вроде археологической летописи древних вирусных инфекций, с которыми приходилось когда-то сталкиваться данному виду или его предкам.

Молекулярные биологи из нескольких научных учреждений Сиэтла (США, штат Вашингтон) занялись изучением эндогенного ретровируса PtERV1 (Pan troglodytes endogenous retrovirus), сотни копий которого присутствуют в геномах шимпанзе и гориллы. В человеческом геноме этого ретровируса нет. При этом, однако, у человека есть защитный антивирусный белок TRIM5α (компонент системы врожденного иммунитета), который эффективно защищает нас от неопасного для человека ретровируса, отдаленно напоминающего PtERV1 — вируса лейкемии мышей N-MLV.

Интерес к белку TRIM5α — одному из сотен бойцов противовирусного фронта — связан с тем, что у многих приматов (например, у тех же горилл) этот белок обеспечивает эффективную защиту от ВИЧ (HIV-1), а у человека, к несчастью, он совершенно бессилен против этой смертельной инфекции.

Эволюция TRIM5α у приматов протекала очень интенсивно. Этот белок распознает белки оболочки (капсида) ретровируса, прикрепляется к ним и способствует разрушению вирусной частицы. Та часть белка TRIM5α, которая отвечает за узнавание капсидных белков, чаще других попадала под действие отбора и претерпевала быстрые эволюционные изменения (это видно по высокой доле значимых нуклеотидных замен по сравнению с незначимыми или синонимичными). Как минимум один раз это произошло и в человеческой эволюционной линии после ее отделения от линии шимпанзе.

Картина, в общем, ясная: время от времени разные виды приматов сталкивались с какой-нибудь новой опасной ретровирусной инфекцией, и в результате отбирались те варианты TRIM5α, которые обеспечивали наиболее эффективную защиту от данного ретровируса.

Ученые предположили, что человеческий вариант TRIM5α, возможно, был адаптирован для борьбы с древним вирусом PtERV1, который 3-4 млн лет назад поразил предков шимпанзе и горилл и, возможно, представлял угрозу также и для наших предков австралопитеков. Возраст вируса (3-4 млн лет) был установлен по числу различий, накопившихся между разными копиями PtERV1, сохранившимися в геномах шимпанзе и горилл.

Сопоставление этих копий также позволило реконструировать исходную нуклеотидную последовательность вирусного генома, а заодно и доказать, что все копии действительно происходят от единого общего предка, которым когда-то заразились гориллы и шимпанзе.

После этого ученые частично воскресили ископаемый вирус. За основу был взят вирус мышиной лейкемии, часть генома которого была заменена реконструированными последовательностями PtERV1. В частности, заменили ген, кодирующий капсидный белок — тот самый, который распознается защитным белком TRIM5α. Получившийся химерный вирус оказался вполне жизнеспособным (в дальнейшем будем называть его просто вирусом PtERV1, поскольку те части его генома, которые остались от вируса мышиной лейкемии, в контексте данного исследования ни на что не влияют).

Ученые проверяли инфекционность вирусов и эффективность защитных белков на лабораторной культуре почечных фибробластов кошки. Эти клетки, как было показано ранее, не имеют никаких средств защиты от известных ретровирусов. В них, однако, можно внедрять чужеродные гены (например, ген человеческого белка TRIM5α), и тогда клетки могут приобрести устойчивость к тем или иным вирусным инфекциям.

Оказалось, что человеческий TRIM5α весьма эффективно защищает клетки от вируса PtERV1. Вирус заразил 4,1% контрольных «беззащитных» клеток и только 0,03% клеток, вырабатывающих человеческий TRIM5α. Таким образом, люди обладают мощным врожденным иммунитетом к доисторическому вирусу, которого давно нет в природе.

Затем исследователи решили выяснить, какие изменения в белке TRIM5α обеспечили его эффективность по отношению к PtERV1. Ранее было установлено, что важную роль в распознавании белком TRIM5α тех или иных вирусов играет маленький участок белковой молекулы длиной в 10 аминокислот, с 330-й по 339-ю позицию. Внимание исследователей привлекла позиция 332. У предков человекообразных здесь стояла аминокислота глутамин (Q). Это предковое состояние сохранилось у гиббонов, орангутанов и горилл, а у человека и шимпанзе глутамин заменился аргинином (R).

Исследователи модифицировали человеческий белок TRIM5α, заменив аргинин в 332-й позиции «предковым» глутамином. Результат превзошел все ожидания: модифицированный белок стал в 30 раз хуже защищать клетки от ископаемого вируса PtERV1, но зато приобрел способность защищать их от ВИЧ!

Это навело ученых на мысль, что, возможно, белок TRIM5α так устроен, что может эффективно распознавать только один из двух типов ретровирусов: если он в ходе эволюции «настроился» на PtERV1, то не может распознать ВИЧ, и наоборот. Для проверки этого предположения они экспериментально определили эффективность белков TRIM5α разных видов приматов в отношении обоих вирусов. Предположение полностью подтвердилось. Белок TRIM5α человека, шимпанзе и мангобея (Cercocebus atys) эффективен против PtERV1, но бессилен против ВИЧ. У гориллы, павиана (Papio anubis) и зеленой мартышки (Cercopithecus aethiops) тот же белок хорошо защищает от ВИЧ, но не эффективен против PtERV1. Это показывает, что белок TRIM5α, по видимому, не может быть одновременно «настроен» на оба типа вирусов.

Эффективность белка TRIM5α против вирусов PtERV1 и ВИЧ (HIV-1). Вверху — схема строения белка TRIM5α, показаны основные функциональные блоки (домены). Домен B30.2 служит для узнавания капсидных белков ретровирусов. Показан ключевой участок этого домена («patch»), включающий 10 аминокислот. Звездочкой отмечена аминокислота, стоящая в 332-й позиции. Внизу слева — эволюционное древо исследованных видов приматов. Две колонки цифр справа отражают эффективность защиты клеток белком TRIM5α от вирусов. Каждое число показывает, во сколько раз меньше клеток заражает вирус, если клетки производят белок TRIM5α. Рис. из обсуждаемой статьи в Science

Возможно, 3-4 млн лет назад среди африканских приматов — предков нынешних горилл, шимпанзе и людей — разразилась эпидемия опасного заболевания, вызываемого вирусом PtERV1. Это способствовало отбору таких мутаций в гене белка TRIM5α, которые повышали устойчивость к инфекции. В частности, у предков людей и шимпанзе глутамин в 332-й позиции заменился аргинином. Гориллы справились с напастью как-то иначе (не следует забывать, что белок TRIM5α — это лишь один из множества барьеров, стоящих на пути вирусных инфекций). Конечно, возможны и другие варианты объяснения обнаруженных фактов, но этот представляется авторам наиболее вероятным. Почему у шимпанзе и горилл вирус сумел проникнуть в геном половых клеток, а у человека нет — на этот вопрос пока нет ответа.

Сегодня, когда вируса PtERV1 больше не существует, зато человечеству угрожает эпидемия ВИЧ, вектор отбора должен был измениться. Вполне можно ожидать, что если бы ВИЧ продолжал косить людей, скажем, еще несколько тысячелетий, злосчастный аргинин снова в результате мутаций и отбора заменился бы глутамином, и другие полезные мутации генов врожденного иммунитета тоже могли бы закрепиться. Впрочем, будем надеяться, что медицина, вооруженная современными генетическими методами, справится с бедой быстрее, чем это сделала бы эволюция.

Источник: Shari M. Kaiser, Harmit S. Malik, Michael Emerman. Restriction of an Extinct Retrovirus by the Human TRIM5α Antiviral Protein //Science. 2007. V. 316. P. 1756-1758.

Александр Марков

Белок сайт-специфичная рекомбиназа (цветная, внизу) прикрепился к двойной спирали ДНК (белая, вверху). Изображение с сайта www.nature.com

Имеющиеся на сегодняшний день методы лечения ВИЧ мешают вирусу внедряться в геном хозяина, но если внедрение всё же произошло, клетка становится неизлечимой. Методом «искусственной эволюции» германские ученые создали белок, способный удалять из генома зараженных клеток наследственный материал вируса. К сожалению, пока неясно, как доставить спасительный белок в зараженные клетки.

Сегодня уже существует ряд методов лечения вируса иммунодефицита человека (ВИЧ), которые позволяют перевести заболевание в хроническую форму и продлить жизнь зараженных людей. Имеющиеся препараты направлены против разных стадий жизненного цикла вируса — одни из них блокируют механизм проникновения вируса в клетку, другие выводят из строя вирусную обратную транскриптазу — фермент, при помощи которого вирус переписывает свою наследственную информацию в геном хозяйской клетки. Все эти методы, однако, не позволяют вылечить те клетки, в геном которых вирус уже успел переписаться. Пока в геноме зараженной клетки присутствует провирус (так называется копия вирусного генома, встроенная в хозяйский геном), вирус будет постоянно воскресать.

Германские ученые при помощи метода искусственной эволюции получили фермент, способный находить провирус ВИЧ в геноме клетки и вырезать его оттуда. За основу был взят белок Cre (cyclic recombinase), относящийся к классу так называемых сайт-специфичных рекомбиназ (site-specific recombinase). Этот белок, широко применяемый биологами для различных манипуляций с ДНК, изначально был выделен из вируса-бактериофага P1. Белок Cre узнаёт две расположенные на некотором расстоянии друг от друга последовательности из 34 нуклеотидов и вырезает участок ДНК, расположенный между ними. Последовательность, распознаваемая белком Cre, получила название LoxP (locus of X-over P1)

У провируса ВИЧ на концах имеются особые последовательности-палиндромы, или обращенные повторы (так называемые long terminal repeats, LTR) — это характерная черта многих вирусов и мобильных генетических элементов, таких как транспозоны и ретротранспозоны. Ученые решили искусственно вывести такую разновидность белка Cre, которая вместо «родной» последовательности LoxP узнавала бы какой-то участок концевых повторов провируса ВИЧ.

Сначала в концевых повторах ВИЧ был найден участок, наиболее сходный с LoxP. Его назвали LoxLTR. Сходство оказалось довольно низким: совпадало лишь 17 нуклеотидов из 34. Исходный белок Cre наотрез отказался «признавать» эту последовательность. Не помогло и внесение в белок разнообразных небольших изменений (мутаций). Стало ясно, что для создания необходимого фермента в белок Cre должен быть внесен целый комплекс изменений, который невозможно угадать методом проб и ошибок — слишком много вариантов пришлось бы перебрать.

Тогда ученые решили расчленить задачу, оказавшуюся слишком сложной, на составные части, и решать их по отдельности. Для этого было изготовлено и внедрено в геном подопытного объекта (кишечной палочки) несколько модифицированных вариантов LoxLTR, более похожих на LoxP, чем исходная версия. «Задача» в данном случае — это 17 нуклеотидов, отличающих LoxLTR от LoxP, а «расчленение задачи» состояло в том, что каждый из модифицированных вариантов LoxLTR содержал лишь некоторые из этих 17 отличий, а в остальном был идентичен LoxP.

Теперь дело пошло лучше: для каждого из модифицированных вариантов LoxLTR удалось подобрать такие модификации Cre, которые хоть и с трудом, но всё же узнавали их. Так из различных вариантов белка Cre были отобраны «перспективные кандидаты». В них снова раз за разом вносили небольшие случайные изменения и проводили отбор на способность распознавать данную последовательность нуклеотидов. В результате были получены белки, уверенно и безошибочно распознающие тестируемые последовательности нуклеотидов (модифицированные LoxLTR) и вырезающие куски ДНК, расположенные между ними.

Последовательность LoxP, которую распознает исходный белок Cre, и наиболее похожий на нее участок в геноме ВИЧ (LoxLTR). Ниже показаны различные модификации последовательности LoxLTR, использованные в экспериментах по искусственной эволюции. Можно заметить, что последовательность LoxP, не считая центральных 8 нуклеотидов, представляет собой палиндром — левая часть комплементарна правой, прочтенной в обратном порядке. К таким последовательностям ДНК-связывающие белки (например, сайт-специфичные рекомбиназы) обычно прикрепляются по два, в виде димеров, как показано на рисунке. Последовательность LoxLTR не является палиндромом, что создало исследователям дополнительные трудности. Рис. из обсуждаемой статьи в Science

Ни один из этих белков, однако, еще не мог распознать реальную последовательность LoxLTR — ту, которая присутствует в геноме ВИЧ. Каждый из них научился узнавать лишь отдельные признаки этой последовательности. Это произошло благодаря тому, что в каждом белке зафиксировались определенные полезные мутации — в каждом случае разные. Теперь нужно было объединить их все в одной белковой молекуле. Для этого ученые стали комбинировать фрагменты отобранных белков, и среди получившихся вариантов нашлись такие, которые с низкой эффективностью могли вырезать провирус ВИЧ из генома. Еще несколько циклов искусственной эволюции — и в распоряжении исследователей оказался новый белок, отлично справляющийся с поставленной задачей. Он получил название Tre. Новый фермент, как выяснилось, сильно отличается от своего прототипа — белка Cre. Замене подверглись целых 19 аминокислот.

Белок Tre протестировали не только на кишечной палочке, но и в культуре клеток человека, геном которых содержал провирус ВИЧ со встроенным геном светящегося белка. Свечение этих клеток сигнализировало о присутствии активного провируса. Когда в эти клетки был внедрен ген, кодирующий белок Tre, две трети клеток перестали светиться. Последующий анализ генома клеток подтвердил, что провирус был оттуда вырезан. Никаких вредных побочных эффектов выявлено не было.

Авторы признают, что их открытие едва ли будет использовано в медицинской практике в ближайшие годы. Непонятно, как доставить белок Tre в зараженные клетки и как при этом избежать побочных последствий, которые обязательно появятся на уровне целого организма — хотя их и не было на уровне отдельных клеток. Важность данной работы в том, что она открывает принципиально новый путь, новую стратегию в борьбе с ВИЧ.

Александр Марков

Рис. 1. Распределение скорости жидкости в ламинарном безвихревом течении по трубе — течении Пуазейля. Максимум скорости наблюдается на оси трубы. Рисунок с сайта ru.wikipedia.org

В исследовании кровеносной системы человека долгое время оставалось неясным, почему в тонких сосудах геометрия движущихся эритроцитов не обладает симметрией (они напоминают по форме тапочку). Как показало численное моделирование ученых из Марокко, США и Франции, принятие эритроцитами несимметричной формы компенсирует возникающую разность в скоростях между ними и внешним течением, обеспечивая таким образом наиболее эффективное протекание крови. Результаты работы ученых могут быть использованы для диагностики различных заболеваний, например малярии.

С точки зрения гидродинамики кровь является неоднородной жидкостью: в среднем на 45% она состоит из красных кровяных телец — эритроцитов, остальное — плазма, практически полностью состоящая из воды; лейкоциты (белые кровяные тельца), тромбоциты и другие элементы крови занимают в ней менее 1%. Основная задача красных кровяных телец — транспортировка кислорода к тканям. В покое эритроциты представляют собой двояковогнутый диск размером 6–8 мкм с мембраной (эластичной оболочкой) толщиной приблизительно 2 мкм.

Сложная структура крови приводит к тому, что описание ее динамических характеристик несколько отличается от описания традиционных жидкостей. Несмотря на это ученые смело используют некоторые приемы и упрощения из традиционной гидродинамики. Приведем пример. В наиболее простой и общей модели системы кровообращения сердце — это насос, создающий направленное движение крови в «трубах»: артериях, венах и капиллярах. Принято считать, что протекание крови ламинарное (то есть безвихревое), при этом профиль распределения скорости внутри сосудов носит параболический характер (рис. 1). Максимальная скорость течения наблюдается на оси сосуда, посередине, а на его краях жидкость неподвижна (см. также анимацию). Этот простой вид течения известен в физике как течение Пуазейля.

Разумеется, изучение гидродинамики кровеносной системы носит не только теоретический характер. Прикладной аспект этих исследований не менее важен. Ведь понимание механизмов, влияющих на эффективность протекания крови в сосудах, должно помочь в предотвращении серьезных заболеваний, например ишемической болезни сердца.

Один из таких механизмов до сих пор оставался неясен. Речь идет о воздействии движения плазмы в небольших сосудах (с диаметром всего в несколько раз превышающим характерный размер эритроцитов) на скорость и форму красных кровяных телец, и наоборот. В частности, почему форма эритроцитов часто несимметрична даже тогда, когда течение плазмы описывается как течение Пуазейля? Ведь логично было бы предположить, что симметричный профиль течения должен обуславливать и симметричную форму красных кровяных телец. Исследования показывают, что, действительно, часть эритроцитов при движении по сосудам имеет парашютообразный вид, то есть обладает симметрией. Однако другие эритроциты искажают свою правильную форму, становятся асимметричными и напоминают по форме тапочку (slipper-like). Что и зачем заставляет эритроциты так преображаться?

Группе ученых из Марокко, США и Франции удалось ответить на этот вопрос. Результаты их теоретических исследований опубликованы в журнале Physical Review Letters в статье Why Do Red Blood Cells Have Asymmetric Shapes Even in a Symmetric Flow? (в открытом доступе работа находится здесь, PDF, 425 Кб).

Авторы статьи догадались, что для того, чтобы определить вид движущихся красных кровяных телец, необходимо вычислить величину и направление скорости каждой точки их эластичной (подверженной деформации со стороны течения плазмы) оболочки. В целях упрощения они свели решение это задачи к 2D-случаю, считая эритроцит двумерной фигурой и рассматривая двумерное течение крови. Конечно же, такой шаг ученых вызывает некоторое недоверие, но, в конце концов, ими был получен правдоподобный результат, а значит, это приближение себя оправдывает.

Записав соответствующие уравнения и затем решив их, исследователи выяснили, что главный параметр, определяющий форму эритроцитов, — это параметр уменьшения ν, то есть отношение площади эритроцита к площади окружности, имеющей тот же периметр, что и фигура красного кровяного тельца. Ученые доказали, что ниже определенного критического значения ν_кр симметричный вид эритроцитов под действием внешнего течения плазмы теряет устойчивость и превращается в асимметричный, имеющий форму тапочки.

Вот некоторые подробности численного моделирования. Если принять максимальную скорость течения крови 800 мкм/с (типичное значение в маленькой вене), радиус сосуда принять в 10 раз большим, чем характерный размер эритроцитов (приблизительно 60–80 мкм), вязкость плазмы приравнять к вязкости обычной воды, а также считать, что жесткость мембраны известна и равна 10^–19 Дж, то ν_крсоставит 0,7. Следовательно, эритроциты с параметром уменьшения, большим 0,7, находящиеся даже не на оси сосуда, мигрируют в середину «трубы» и сохраняют симметричную форму парашютов, устойчивую к любого рода возмущениям. Но как только параметр уменьшения становится меньше 0,7, форма эритроцита становится нестабильной, и он принимает вид тапочка.

Так выглядит математический критерий трансформации эритроцитов из симметричного вида в несимметричный. Физическая же причина, диктующая эритроциту несимметричную форму, заключается в запаздывании скорости красного кровяного тельца по отношению к внешнему течению плазмы. Предположим, что в сосуде движется парашютообразный эритроцит с ν меньше критического значения. Согласно расчетам, по мере его продвижения в сосуде разность скоростей между внешним течением крови и собственно скоростью красного кровяного тельца будет увеличиваться. Увеличивающаяся разность скоростей приводит к нестабильности мембраны и к понижению эффективности прохождения эритроцитов в сосуде — красные кровяные тельца начинают «подтормаживать». Для кровеносной системы единственный путь компенсации разности скоростей — изменить форму оболочки эритроцита. Всё то же численное моделирование утверждает, что лучшим способом будет принятие красными кровяными тельцами несимметричного вида — формы тапочки. В итоге различие в скоростях уменьшается, а оболочка в форме тапочки становится для эритроцита доминирующей.

Конечно же, у разных сосудов ширина разная, как и скорость течения крови в них, поэтому авторы проанализировали все возможные реалистичные данные, построив фазовую диаграмму перехода эритроцитов от симметричного вида к несимметричному (рис. 2) для заданной ширины сосуда (отношение радиуса сосуда к характерному размеру эритроцита равнялось 10).

Рис. 2. Форма эритроцита в состоянии покоя обладает симметрией (верхний рисунок). Симметричное распределение скоростей в кровеносном сосуде предполагает симметричный вид движущихся эритроцитов (левый рисунок). Однако это не всегда соответствует действительности. Ученые из Марокко, США и Франции доказали, что в тонких сосудах симметрия красных кровяных телец уменьшает эффективность их протекания. Переход от парашютообразной формы эритроцитов к несимметричной форме тапочки определяется параметром уменьшения ν. Справа внизу приведена фазовая диаграмма перехода: параметр уменьшения ν / максимальная скорость потока плазмы (измеряется в мкм/с — микрометрах в секунду). Отношение диаметра сосуда к характерному размеру эритроцита равняется 10. Рисунок с сайта physics.aps.org

Как видим, для каждого значения скорости течения имеется свое критическое значение параметра уменьшения ν_кр (черная ломаная кривая на графике). Интересно, что цитоскелет (внутреннее строение) эритроцитов, как показали авторы статьи, не оказывает какого-либо влияния на их переход от парашютообразной формы к форме тапочки.

В своих изысканиях ученые пришли к еще одному важному результату. В медицине известно, что некоторые болезни, например малярия, приводят к потере эластичности эритроцитных мембран. Отражается ли это на виде эритроцита? Оказывается, да. Исследователи обнаружили, что увеличение в два и более раза жесткости оболочки приводит к существенному изменению формы красных кровяных телец — наблюдается их «симметризация» (рис. 3).

Рис. 3. Эволюция несимметричной формы эритроцита («тапочки») при увеличении жесткости его мембраны в 1,5, 2 и 5 раз соответственно. Рисунок из обсуждаемой статьи в Phys. Rev. Lett.

По мнению авторов, данный результат может быть использован в диагностике различных патологий кровеносной системы.

Источник: Badr Kaoui, George Biros, Chaouqi Misbah. Why Do Red Blood Cells Have Asymmetric Shapes Even in a Symmetric Flow? // Phys. Rev. Lett. 103, 188101 (2009).

См. также:
Howard A. Stone, Alison M. Forsyth, Jiandi Wan. Slipping through blood flow // Physics 2, 89 (2009).

Юрий Ерин